本发明公开了一种人工小口径血管及其制备方法,包括采用原花青素对血管的天然胞外基质进行交联的步骤。本发明的人工小口径血管力学强度和稳定性提高,无毒,抗体内酶降解,抗钙化,抗血小板黏附,免疫原性低,交联剂和小口径血管本身蛋白质释放极微。这些交联特性使本发明的人工小口径血管在植入体内后,利于人体自身小口径血管平滑肌细胞和血管内皮细胞的移入、增殖、覆盖和长期抗钙化。
1.人工小口径血管的制备方法,所述人工小口径血管含有经原花青素交联处理的哺乳动物小口径血管天然胞外基质,其特征在于,所述方法包括使用D-Hanks液溶解的原花青素作为交联剂对脱细胞的哺乳动物小口径血管材料进行交联处理的步骤,其中,采用以下步骤对所述哺乳动物小口径血管材料实施脱细胞处理:(a)将清洗后的血管浸泡在D-Hanks溶液中;(b)用含有0.20~0.30%的胰蛋白酶的D-Hanks溶液灌流,然后浸泡在该D-Hanks溶液中,30~40°C下消化;(c)灌流4°C以下的D-Hanks溶液终止消化,清洗;(d)将步骤(c)所得血管浸入包含tritonxa0X-100、脱氧胆酸钠和乙二胺四乙酸二钠溶液的D-Hanks混合溶液中,持续温和摇动,以脱去血管表面和内部的细胞;(e)将步骤(d)所得血管依次浸泡在用D-Hanks液配制的核糖核酸酶溶液和用D-Hanks液配制的脱氧核糖核酸酶溶液中,或者浸泡在含有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的混合溶液中,以除去小口径血管内部细胞残余的细胞核成分;和(f)清洗步骤(e)所得血管,从而实现脱细胞处理。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述哺乳动物小口径血管材料来自新鲜的哺乳动物颈动脉和隐静脉血管。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述脱细胞处理前还包括用1~6°C的D-Hanks溶液清洗清除了脂肪和杂质的血管。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述交联通过以每厘米血管长度1~10mL含0.1~10mg/mL原花青素的D-Hanks溶液浸泡脱细胞的哺乳动物小口径血管材料而实现。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述原花青素的浓度为2.5~5mg/mL,以每厘米血管长度3~5mL的量使用该含花青素的D-Hanks溶液。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,交联条件为4~40°C下60~360rpm摇动交联1~96小时。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,交联条件为30~40°C,摇动转速为120~180rpm,交联时间为24~72小时。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(c)中的D-Hanks混合溶液为含有0.3~0.6%tritonxa0X-100、0.3~0.6%脱氧胆酸钠和0.01~0.05%乙二胺四乙酸二钠的D-Hanks溶液。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(d)中的核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的浓度分别为10~30μg/mL和100~300μg/mL。
10.采用权利要求1~9中任一项所述方法制备得到的人工小口径血管。
11.如权利要求10所述的人工小口径血管,其特征在于,所述哺乳动物选自牛、猪、羊、兔和狗。
12.如权利要求10~11中任一项所述的人工小口径血管,其特征在于,所述哺乳动物小口径血管选自哺乳动物的颈动脉和隐静脉血管。
13.如权利要求10所述的人工小口径血管,其特征在于,每厘米所述人工小口径血管含有3~15mg原花青素。
14.如权利要求10所述的人工小口径血管,其特征在于,所述人工小口径血管的最大抗张强度在4~11MPa的范围之内。
15.一种组合物,其特征在于,所述组合物含有权利要求10~14任一项所述的人工小口径血管和用于保存该血管的溶液。技术领域
本发明属生物医学工程学领域,涉及一种人工小口径血管的交联制备方法。技术背景心血管病和外周血管病具有很高的发病率、致残率和致死率[1],2003年世界卫生组织报告,全世界每年约有1670万人死于心血管病,占总死亡人数的1/3[2]。初步统计,我国每年大约有260万人死于心血管病,每12秒钟,就有一人死于该病,每15秒钟,就有一人因该病丧失工作能力。我国心血管病发病人数每年都在上升,所引起的死亡已经占到疾病死亡人数的44%左右[3],这其中以小血管病变更为常见。治疗严重小血管病变的常用办法是,取自身大隐静脉(saphenousxa0vein)、乳房动脉(internalxa0artery)和放射状动脉(radialxa0artery)移植,做搭桥(bypass)手术,但约有10%的患者没有健康可供移植的自身小血管。因此小血管病变的修复便需要人工小血管替代。而常用的人工合成材料涤纶(Dacron)和聚四氟乙烯(ePTFE)制成的小血管,常因弹性差、不柔顺、严重血栓、动脉瘤和感染等造成修复失败[4,5]。小于6mm直径的小血管仅6个月后血栓率就超过40%[6]。所以人们将修复的希望寄托于新型生物材料的应用和组织工程构建。我国是人口大国,随着老龄化的增长,发病率将进一步增高,小直径人工血管的需求将是一个很大的市场。面对需求,有必要加大研究力度,逐步促成我国在这个市场中拥有自主知识产权的产品。血管由内到外分为三层结构:内膜层(intima),中膜(media)和外膜(adventitia)。内膜是一层排列紧密的内皮细胞层构成,内皮细胞层通过多糖性细胞间质与很薄的内膜下层黏结。内膜下层是结缔组织,由多条环状弹性蛋白带以及胶原蛋白相互交织而成。中膜由多层平滑肌细胞和结缔组织细胞组成,细胞层间是环行排列的很厚的弹性蛋白纤维和多糖基质。外膜由结缔组织细胞和神经细胞组成。结缔组织富含相互交织的胶原蛋白和弹性蛋白。血管所处的环境为内膜与血液接触,外膜与体液接触。从病理生理学角度,血管内皮损伤后,细胞外基质或人工支架暴露于血液,引起血小板聚集,形成血栓。随着时间的推移,血管平滑肌细胞迁移、增殖并分泌沉积大量胞外基质,导致内膜增生,使血管狭窄,进一步促进局部血栓,引起受血部位的器官如大脑、心肌和肢体末端出现缺血损伤症状。小血管修复后再狭窄,也主要是由于内膜增生和血小板聚集二者共同作用引起[7]。理想的小口径人工血管应该具有以下性能[6,8,9]:(1)生物相容性,包括不引起血栓,无免疫原性,抗感染;(2)具有连续、不活化的内皮层,该内皮层有应激修复能力,但不会引起炎症、钙化、肥大性增生、纤维囊形成等,利于长久抗血栓;(3)能够在体内局部环境的作用下进行重塑(remodeling),最终成为自体血管的一部分,并与自体血管没有明显区别;(4)具备适当的机械性能,包括生理环境下适当的抗拉伸强度,弹性摸量,可弯曲能力,耐血流长期剪切作用,不形成动脉瘤,尤其要能耐受极端血压冲击;(5)具备适当的渗透能力,保证水分和溶解于水的物质,甚至一些细胞可以透过;(6)具备生理活性,如血管收缩/舒张反应,以维持正常血压;(7)便于临床处理和缝合。显然,用于制备大血管的dacron和ePTFE材料不可能满足上述要求。近年来,研究人员采用新型生物材料支架结合组织工程学的原理、方法、技术构建组织工程小口径人工血管(Tissuexa0engineeringxa0bloodxa0vessel,TEBV),发展了多种构建方法。这些方法主要分为4类:(1)合成高分子支架;(2)细胞薄膜的“组织自组装”方法;(3)水凝胶和生物聚合物支架;(4)脱细胞组织支架。这4类方法分别都取得了可喜进展[5]。生物可降解高分子材料,如聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸、聚羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkanoate)、聚-4-羟基丁酸酯、聚己酸内酯-共-聚乳酸和聚乙二醇等,作为组织工程支架材料,可以很快成型为各种形状,可以保证所需的力学强度,可以在成型后种植细胞,植入体内后材料可被降解吸收,其降解吸收速率可依据利于体内重塑的要求,调整化学组成而调控。但其弹性和柔顺度难以与正常血管匹配,没有在体外构建成熟的组织工程血管,植入体内后支架材料的降解速度难以与细胞新形成的胞外基质(extracellularxa0matrix,ECM)速度相匹配,容易引起血栓等严重问题。高分子材料支架复合以患者自身细胞,体外构建成熟的血管,已有一些临床应用成功的病例[10]。不过,这些病例植入的都是替代低血压(20~30mmHg)肺循环的血管,其构建时间长,不能随时取用。Niklason等在体外加脉冲压力动态培养构建,力学强度有很大提高,但植入后仍有材料引起的炎症反应[6]。这类方法值得借鉴之处在于,支架复合细胞后,利用力学刺激环境提高人工血管的力学性能,促进其重塑与成熟。细胞薄膜的“组织自组装”方法是,将血管平滑肌细胞(SMC)培养于培养皿,加抗坏血酸,促其分泌大量胶原蛋白形成薄膜,将形成的薄膜用多孔小管卷成血管结构,再将内表面培养一层内皮细胞,再在外面包裹一层成纤维细胞薄膜,继续旋转培养,最后形成血管典型的3层结构。这样构建的血管其力学强度可支持相当于大隐静脉的血压(1680mmHg)。但其管壁中缺少弹性蛋白,柔顺度虽然较ePTFE好,但比正常小血管差很多,容易引起内膜增生性再狭窄[5]。这类方法值得借鉴之处在于,充分利用细胞本身的合成作用,以及利用旋转培养方法促进血管结构形成。生物聚合物或水凝胶支架由I型胶原蛋白和纤溶蛋白构成,加上内皮细胞和平滑肌细胞即构建成“生物人工动脉血管”(bioartificialxa0artery,BAA)。I型胶原蛋白是人体含量最高、最常见的蛋白,也是细胞主要的天然支架材料。纤溶蛋白能够促进组织修复。将二者复合,加上细胞并压紧后,通过旋转培养可大量扩增细胞,促使纤溶蛋白形成围绕血管壁排列结构,并可诱导平滑肌细胞也围绕血管壁紧密排列,形成更近似于正常血管中膜的结构,提高了力学强度,同时也促进细胞更容易实现对血管的重塑。遗憾的是,这样的血管也没有弹性蛋白形成,仅靠细胞规则排列还不能实现较高的力学强度,仅能承受很低的血压(约300mmHg)。目前这种血管还在做各种交联处理和添加弹性蛋白,以提高力学强度[5]。该类方法值得借鉴之处在于:充分利用细胞的天然支架材料I型胶原蛋白和弹性蛋白以及重塑促进因子纤溶蛋白。但上述方法也还存在问题,无法实现临床应用。综合起来,目前各类TEBV构建方法还存在以下几大关键问题需要解决[5]:(1)TEBV必须具有有充足细胞来源的内皮细胞衬里,确保其没有血栓诱导因子;(2)TEBV必须具有适当的机械性能,包括与自体血管相匹配的弹性和拉伸强度;(3)TEBV必须具有体内重塑的能力;(4)不能随时供应临床。而要同时解决这些问题,现有方法还过于复杂,且周期较长:种子细胞来源有限需要培养扩增,构建后需要体外脉动培养。脱细胞组织完全由天然胞外基质组成,基质中含有胶原蛋白、弹性蛋白和纤溶蛋白等,在机械性能方面和生物相容性方面具有极大的优势,可以直接植入体内,原位由宿主细胞再细胞化。脱细胞组织来源广泛,可以是脱细胞血管,可以是小肠黏膜下层(smallxa0intestinalxa0submucosa,SIS)等。一般采用去垢剂、酶、酶抑制剂和缓冲液,以及核酸酶等去除细胞而得到。如果是脱细胞血管,则可基本保持人工血管所要求的结构和组成。然而,脱细胞过程也会带来一些负面影响,如降低了拉伸强度、柔顺度和去除了糖蛋白引起的大幅度收缩等,此外异种组织还容易引起感染和血栓,也抑制再细胞化。SIS虽然能消除一些缺陷,但血栓问题始终难以解决[5]。这些研究提示:如果能够完全脱细胞,提高脱细胞组织材料的拉伸强度,保持柔顺度,保持适当的弹性,抑制钙化,抑制血小板聚集以防血栓形成,那么所制成的血管将较为理想。采用交联剂对脱细胞血管组织进行处理是改善其力学和生物学性能的有效方法。常规动物组织常用戊二醛交联,但戊二醛具有一定的毒性,而且其交联的组织长期植入体内会发生钙化[12]。原花青素(procyanidins,PC)是由2-4个儿茶素((+)catechin)和/或表儿茶素((-)epycatechin)为单体聚合而成[11]的多种聚合物的混合体。PC最初是由地中海沿岸的海岸松(Pinusxa0maritina)树皮中提取而来,现已可从葡萄、山楂、可可和苹果等水果中大量提取,是干红葡萄酒的重要成分,没有任何毒性。PC与蛋白质脯氨酸残基有高亲和力,可结合蛋白质分子表面OH、COO-、NH等,并形成氢键交联。近年来的研究[13,14]发现其可用来交联蛋白质制备生物材料,交联的材料不仅具有优良的力学性能和稳定性,还能抑制钙化。国内也有用PC交联脱细胞心脏瓣膜制备人工生物瓣膜的专利(CN200510110957.2),但心脏瓣膜的结构较简单,仅有外层的内皮细胞和内部的间质细胞,远不如血管壁结构复杂。瓣膜细胞外基质的离心面为胶原蛋白,近心面为弹性蛋白[Frederickxa0J.Schoen,1xa0Robertxa0J.Levy.Tissuexa0heartxa0valves:Currentxa0challengesxa0andxa0futurexa0researchxa0perspectives.Jxa0Biomedxa0Materxa0Res,47,439-465,1999.],二者不相互交叉排列,也不同于血管中的胶原蛋白和弹性蛋白的排列方式。人工生物瓣膜要求高度柔顺,而血管要求适当机械性能,以使管腔不致塌陷。心脏瓣膜所处环境为上下两面均与血液接触,不同于血管仅内膜与血液接触,而外膜与体液接触。人工生物瓣膜对体内细胞能否黏附没有要求,而人工血管内膜细胞黏附实现再细胞化,将能进一步保证人工血管的长期抗血栓性能。本发明采用PC交联脱细胞动物如牛、猪等的小口径血管材料,包括颈动脉或隐静脉脱细胞小口径血管材料,制备性能要求不同于瓣膜的新型人工小口径血管,用作临床所需的小口径血管替代品。
发明内容
本发明的目的,在于提供一种抗张强度高,细胞相容性好、血液相容性优良,抗血栓、抗钙化和低免疫原性的人工生物小口径血管。本发明旨在采用纯天然的、日常食物中存在的、无毒的并具有一定生理保护功效的、全新交联剂,交联脱细胞哺乳动物颈动脉和隐静脉血管材料,或其它来源材料(如来源于猪的小口径血管),制备人工生物小口径血管,以满足临床上病人对小口径血管移植物的需求。本发明通过上述全新交联剂对哺乳动物颈动脉或隐静脉脱细胞小口径血管的交联而实现。与常规戊二醛交联结果相比,本发明制备的小口径血管材料不仅能降低所交联小口径血管的毒性,而且可保持小口径血管的天然形态、柔软性,提高小口径血管的力学强度和稳定性,有良好的血管细胞相容性、血液相容性,低免疫原性,并有较强的抗血栓性能和抑制小口径血管钙化的潜能。与PC交联脱细胞心脏瓣膜相比,由于血管壁中胶原蛋白和弹性蛋白交织排列,PC有更多机会将胶原蛋白和弹性蛋白分子同时交联,稳定或提高血管管腔结构,不致塌陷。本发明提供一种人工小口径血管的制备方法,所述方法包括D-Hanks使用原花青素作为交联剂对脱细胞的哺乳动物小口径血管材料进行交联处理的步骤。在一具体实施例中,所述方法包括以下步骤:(1)获得哺乳动物小口径血管材料;(2)对所述小口径血管材料进行脱细胞处理,获得仍保存血管形状的天然胞外基质;和(3)使用原花青素交联所述天然胞外基质。在一具体实施例中,所述哺乳动物小口径血管材料来自新鲜的哺乳动物颈动脉和隐静脉血管。在一具体实施例中,所述脱细胞处理包括:(a)将清洗后的血管浸泡在D-Hanks溶液中;(b)用含有0.20~0.30%的胰蛋白酶的D-Hanks溶液灌流,然后浸泡在该D-Hanks溶液中,30~40°C下消化;(c)灌流4°C以下的D-Hanks溶液终止消化,清洗;(d)将步骤(c)所得血管浸入包含tritonxa0X-100、脱氧胆酸钠和乙二胺四乙酸二钠溶液的D-Hanks混合溶液中,持续温和摇动,以脱去血管表面和内部的细胞;(e)将步骤(d)所得血管依次浸泡在用D-Hanks液配制的核糖核酸酶溶液和用D-Hanks液配制的脱氧核糖核酸酶溶液中,或者浸泡在含有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的混合溶液中,以除去小口径血管内部细胞残余的细胞核成分;和(f)清洗步骤(e)所得血管,从而实现脱细胞处理。在一具体实施例中,所述脱细胞处理前还包括用1~6°C的D-Hanks溶液清洗清除了脂肪和杂质的血管。在一具体实施例中,所述交联通过以每厘米血管长度1~10mL含0.1~10mg/mL原花青素的D-Hanks溶液浸泡脱细胞的哺乳动物小口径血管材料而实现。在一具体实施例中,所述原花青素的浓度为2.5~5mg/mL,以每厘米血管长度3~5mL的量使用该含花青素的D-Hanks溶液。在一具体实施例中,交联条件为4~40°C下60~360rpm摇动交联1~96小时。在一具体实施例中,交联条件为30~40°C,摇动转速为120~180rpm,交联时间为24~72小时。在一具体实施例中,所述步骤(c)中的D-Hanks混合溶液为含有0.3~0.6%tritonxa0X-100、0.3~0.6%脱氧胆酸钠和0.01~0.05%乙二胺四乙酸二钠的D-Hanks溶液。在一具体实施例中,所述步骤(d)中的核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的浓度分别为10~30μg/mL和100~300μg/mL。在一具体实施例中,所述方法还包括交联后处理,所述后处理是将交联后的完全脱细胞的小口径血管浸入D-Hanks溶液中1~40天。本发明包括采用本发明方法制备得到的人工小口径血管。在一具体实施例中,本发明的人工小口径血管含有原花青素和哺乳动物小口径血管天然胞外基质。在一具体实施例中,本发明的人工小口径血管含有原花青素和哺乳动物小口径血管脱细胞处理后的产物。在一具体实施例中,本发明的人工小口径血管含有经原花青素交联处理的哺乳动物小口径血管天然胞外基质。在一具体实施例中,本发明在经原花青素交联处理后的人工小口径血管中,每厘米长含有约3~15mg原花青素。在其它实施例中,本发明在经原花青素交联处理后的人工小口径血管中,每厘米长含有约3~8mg原花青素。。在一具体实施例中,所述哺乳动物小口径血管脱细胞处理后的产物为所述天然胞外基质。在一具体实施例中,所述天然胞外基质主要由胶原蛋白、弹性蛋白和纤溶蛋白等组成。在一具体实施例中,所述血管还包括内皮细胞和平滑肌细胞。在一具体实施例中,所述哺乳动物选自牛、猪、羊、兔和狗。在一具体实施例中,所述哺乳动物小口径血管选自哺乳动物的颈动脉和隐静脉血管。本发明提供一种组合物,所述组合物含有本发明的人工小口径血管和用于保存该血管的溶液。
附图说明
图1显示,小牛小口径血管中的细胞成分经脱细胞处理之后细胞已全部去除干净,相对于正常致密的血管壁(图1B),脱细胞血管壁变地疏松而富有空隙(图1D中的箭头),同时血管壁中也无正常壁中的细胞核物质(图1B中的箭头)。图2为本发明的小血管形态照片。可以看出,新鲜血管呈正常的圆柱状,经脱细胞处理后,颜色变白,变软。经戊二醛(GA)和本发明所使用的原花青素交联后都稍变硬,而且随着原花青素交联浓度的增大,硬度有增大趋势。血管呈不同的颜色变化:戊二醛交联后血管呈淡黄色,而PC交联后血管呈棕红色。原花青素在浓度为2.5mg/mL和5mg/mL时交联效果较好。图3为本发明所交联的脱细胞血管样品力学性能的测试结果。图3A显示新鲜血管的最大抗拉强度为1.84MPa,而经脱细胞和交联处理后最大抗拉强度显著增大至2~5倍,而经各个浓度原花青素交联后的最大抗拉强度更大。图3B显示新鲜血管的弹性模量为1.96MPa,而经脱细胞和交联处理后的弹性模量为显著增大至10MPa左右,而经各个浓度原花青素交联后的弹性模量更大。说明本发明原花青素交联处理的脱细胞小口径血管具有较高的力学性能。图4A显示,脱细胞未交联组(对照)胶原酶降解快速,1h降解80%多,24h降解近98%;而本发明原花青素交联组降解速度慢;经胶原酶降解4h后,各个实验组血管降解几乎达到最大值,与24h时间点的降解率并没有明显的差异。因此,选取4h时间点做更精确的降解检测。图4B显示,经胶原酶体外降解4h后,原花青素能有效的抗体外酶降解,与戊二醛的抗降解能力相当。图5A为本发明交联制备的小血管中原花青素的交联稳定性。从中可以看出交联血管浸泡于D-Hanks溶液中初期有小部分未交联的原花青素释放快速,前4天基本释放完毕,30天之后检测不到各个交联浓度血管原花青素的释放。由图5B、5C可以看出随着时间的延长,累积释放量及释放率均增大,前3d增大速度最快,之后平缓增长,最后趋于平稳状态。从释放率图5C可以看出,30d后各个交联浓度的释放率(相当于原始交联溶液中的PC量)分别为24%、20%、25%、27%、27%,基本趋于稳定一致。这些结果说明原花青素能够稳定地存在于被交联的血管中,同时也说明原花青素能够稳定地交联脱细胞血管材料。图6为脱细胞血管样品浸泡于SBF中10d后,脱细胞未交联组(contro1)及6.25mg/mLxa0GA交联组分别生长了致密的一层羟基磷灰石,说明在该位点发生了钙化。而经各个浓度原花青素交联的脱细胞血管亦有零星的沉积位点,EDS显示Ca/P均在1.36~1.57之间,并且随着交联浓度的增大,沉积位点逐渐减少。该结果表明,原花青素交联有明显的抗钙化作用,并且随着浓度的增大,抗钙化能力逐渐加强。原花青素在浓度大于5mg/mL时抗钙化效果较理想。图7为采用脱细胞血管支架表面种植细胞试验来检测交联血管的生物相容性。图7中可以看出,细胞接种2天后,脱细胞未交联对照(contro1)组血管表面细胞生长、伸展较好,形成连续的细胞单层,细胞形态呈鹅卵石状。GA交联血管支架表面并没有细胞贴附生长,可见一些细胞碎片,说明GA具有很强的细胞毒性,而不同浓度原花青素交联的血管支架表面细胞也生长贴附良好,细胞形态良好,随着交联浓度的增大,形成的细胞单层不连续,而高浓度10mg/mL交联组血管表面贴附细胞略少。说明原花青素交联血管支架对细胞的生长没有明显的毒性。图8显示脱去细胞的小牛小口径血管(隐静脉)HE染色照片。图9A为各种交联样品与抗凝血孵育60min后3000rpm离心5min后的照片。可以看出,阳性对照全部溶血(溶血率100%),脱细胞未交联,GA交联,2.5mg/mL原花青素交联组均没有溶血现象。图9B为根据测定的上清OD值,结果计算得出脱细胞未交联血管(control组,n=3)的溶血率为0.49%,而GA和2.5mg/mL原花青素交联血管的溶血率均稍有下降,分别为0.25%,0.35%,溶血率都远低于ISOxa010993-4:2002规定的血液相容性标准最大溶血率5%。因此,原花青素同戊二醛相当,无溶血现象。图10A为血管内表面血小板粘附的扫描电镜照片,可以看出,脱细胞未交联组(control组)表面粘附较多血小板,呈颗粒状,但并未完全覆盖血管表面,仍可见血管纤维结构;6.25mg/mL戊二醛交联组血管表面血小板粘附致密,完全覆盖住血管表面;而2.5mg/mL原花青素交联的血管表面粘附少量血小板,血管纤维状结构清晰可见。图10B显示粘附前后血小板溶液血小板计数(n=3)定量分析结果,表明脱细胞未交联组血小板粘附率为9.10%,戊二醛交联组血小板粘附率显著增大,为21.55%,而原花青素交联组血小板粘附率显著下降,为2.94%,与脱细胞未交联组有显著性差异,与戊二醛交联组有极显著性差异。可见,原花青素能明显的抑制血小板粘附,从而抑制血栓形成。图11为本发明的原花青素交联制备的脱细胞小口径血管的免疫原性测试结果。人单核细胞经PMA诱导处理48h后可分化为巨噬细胞,经D-Hanks洗去未贴壁巨噬细胞后,得到的细胞为巨噬细胞。巨噬细胞处理16h后通过扫描电镜观察细胞的贴壁状况,巨噬细胞黏附越多则免疫原性越强。从图11A可以看出脱细胞未交联血管(Control组)与2.5mg/mL原花青素交联血管表面都有巨噬细胞贴附,形态良好;而戊二醛交联组细胞也有贴附,但细胞呈不规则形态,这进一步说明戊二醛具有细胞毒性。图11B的细胞个数统计可以看出,三组血管间无差异,对巨噬细胞的吸附效果基本一致,相对于Control组,原花青素交联不会引起强免疫原性。
具体实施方式
本发明包括制备人工小口径血管的方法,该方法包括使用原花青素作为交联剂对脱细胞的哺乳动物小口径血管材料进行交联处理的步骤。在一具体实施例中,本发明的制备方法主要包括脱细胞处理和交联处理步骤。在一具体实施例中,本发明的制备方法包括:(1)获得哺乳动物小口径血管材料;(2)对所述小口径血管材料进行脱细胞处理,获得仍保存血管形状的天然胞外基质;和(3)使用原花青素交联所述天然胞外基质。本文中,小口径血管指哺乳动物中内径小于等于6mm的血管。本发明主要采用哺乳动物(优选较大型哺乳动物,例如猪、牛、兔、羊和狗等)的小口径血管制备本发明的人工小口径血管。优选的,使用牛或猪的主动脉;更优选地,使用牛或猪的颈动脉和隐静脉。例如,可取出生48小时左右、体重50±10公斤重、新宰杀的牛颈动脉和隐静脉血管。或者,可取宰杀4小时以内、体重90±30公斤重的猪颈动脉和隐静脉血管。剪取的哺乳动物的小口径血管材料,可放入1~6°C的平衡盐缓冲液D-Hanks液中。用于本发明的D-Hanks溶液的配方如下:xa0xa0成分
xa0xa0用量(g/L)
xa0xa0KCl
xa0xa00.34~0.45,通常约0.4
xa0xa0KH₂PO₄
xa0xa039~41,通常约40.06
xa0xa0NaCl
xa0xa07.50~8.50,通常约8.00
xa0xa0NaHCO₃
xa0xa00.32~0.38,通常约0.35
xa0xa0Na₂HPO₄·7H₂O
xa0xa00.08~0.10,通常约0.09
在本发明的具体实施例中,使用如下配方的D-Hanks溶液:xa0xa0成分
xa0xa0用量(g/L)
xa0xa0KCl
xa0xa00.4
xa0xa0KH₂PO₄
xa0xa040.06
xa0xa0NaCl
xa0xa08.00
xa0xa0NaHCO₃
xa0xa00.35
xa0xa0Na₂HPO₄·7H₂O
xa0xa00.09
D-Hanks溶液的pH通常在7.2~7.4的范围内,通常约为7.4。可使用该D-Hanks溶液配制本发明的其它溶液,例如消化液、脱细胞液、交联溶液等等,以及使用该D-Hanks溶液进行清洗、保存血管等。获得哺乳动物血管材料后,可先清除其脂肪和杂质。然后用1~6°C的D-Hanks液清洗1~10次,通常可清洗3~6次。接着对该血管进行脱细胞处理。脱细胞处理通常包括以下步骤:将清洗后的血管浸泡在30~40°C(优选35~37°C)的D-Hanks溶液中一段时间(通常为20~40分钟,例如30分钟);按每厘米血管长灌流1~5mL预热的(30~40°C,优选35~37°C)浓度为0.20~0.30(优选0.25%)的胰蛋白酶的D-Hanks溶液,优选为灌流3mL溶液;然后浸泡在30~40°C(优选35~37°C)的该D-Hanks溶液中消化1~10分钟,优选为5分钟,以洗掉血管的内皮细胞层;按每厘米血管长度灌流1~5mL的1~6°C的D-Hanks溶液终止消化,再用D-Hanks溶液清洗1~5次;将小口径血管浸入脱细胞液(0.3~0.6%tritonxa0X-100、0.3~0.6%脱氧胆酸钠和0.01~0.05%乙二胺四乙酸二钠的D-Hanks溶液)中1~240小时,优选为48小时,在持续温和摇动的条件下脱去小口径血管表面和内部的细胞,其摇动速度为60~360rpm,优选为120rpm;然后,先后使用10~30μg/mL(优选20μg/mL)的DNA酶和100~300μg/mL(优选200μg/mL)RNA酶脱细胞核,脱细胞核的条件为37±3°C、100~150rpm(优选120rpm)转速摇动,每种消化脱细胞核1~24小时,优选为2小时;或使用10~30μg/mL(优选20μg/mL)DNA酶和100~300μg/mL(优选200μg/mL)RNA酶的混合液脱细胞核,脱细胞核的条件为37±3°C、100~150rpm(优选120rpm)转速摇动,混合消化1~24小时,优选为2小时;DNA酶和RNA酶溶液是由D-Hanks液配制而成。之后再次清洗干净,由此获得脱细胞的血管;清洗液通常为超纯水配制的D-Hanks液,清洗条件通常为10~40°C、10~360rpm转速摇动,通常每1厘米长血管,加10mL以上D-Hanks液,清洗3~20次,每次清洗3小时以上。清洗将除去小口径血管细胞残渣、碎片及游离蛋白质、核酸等大分子。最后用超纯水配制的D-Hanks液储存备用。脱细胞的血管完全由天然胞外基质组成,基质中含有胶原蛋白、弹性蛋白和纤溶蛋白等。应理解,上述脱细胞处理步骤及使用的试剂和处理时间、温度等可根据实际的情况加以选择。然后可对脱细胞的血管进行交联处理。通常,将完全脱细胞的小口径血管浸入用超纯水配制的D-Hanks溶液配制的原花青素溶液(即含原花青素的D-Hanks溶液)进行交联。原花青素溶液中原花青素的浓度为0.1~10mg/mL,优选为2.5~5mg/mL。通常每厘米血管长度用1~10mL(优选3~5mL)原花青素溶液浸泡脱细胞的小口径血管。优选的是,原花青素溶液新鲜配制,保存时间不宜超过1小时。交联条件为4~40°C下60~360rpm摇动交联1~96小时。优选温度为10~40°C,更优选为35~37°C。优选摇动转速为60~240rpm,优选为120~180rpm,更优选为120~150rpm。优选交联时间为24~72小时,更优选为48小时。交联完成后,取出小口径血管材料,在D-Hanks液中清洗干净。交联后的完全脱细胞的小口径血管可浸在D-Hanks液中作后处理。后处理包括用D-Hanks溶液持续清洗1~40天,每天更换D-Hanks溶液。清洗时间优选为3~5天。通常,后处理后未交联的PC在3~5天内基本上全部释放。之后即可得到本发明的小口径血管材料。之后可将该小口径血管材料保存于D-Hanks液中备用,保存温度1~10°C,优选为2~4°C。因此,本发明也包括采用本文所述方法制备得到的人工小口径血管。在一具体实施例中,本发明的人工小口径血管含有原花青素和哺乳动物小口径血管天然胞外基质。在另一具体实施例中,本发明的人工小口径血管含有经原花青素交联处理的哺乳动物小口径血管天然胞外基质。应理解,本文所述“天然胞外基质”指经本发明方法处理后脱细胞的血管天然细胞外基质。本发明的人工小口径血管每厘米可含有或交联有约3~15mg原花青素。在一些实施例中,每厘米可含有或交联有约3~8mg原花青素。本发明的人工小口径血管的最大抗张强度在4~11MPa的范围之内。在一些实施例中,采用该方法所测试的最大抗张强度在8~11MPa的范围之内。可使用例如SHIMADZU材料测试仪器以例如2mm/min的速率测试最大抗张强度。本发明的人工小口径血管的溶血率低于ISOxa010993-4:2002规定的血液相容性标准最大溶血率5%,优选在4%以下、3%以下、2%以下、1%以下、0.5%以下。本发明也包括经体外培养而粘附有内皮细胞和平滑肌细胞的本发明人工小口径血管。在优选的实施例中,本发明的人工小口径血管来自哺乳动物尤其是猪和牛的颈动脉和隐静脉血管。本发明也提供一种组合物,所述组合物含有本发明的人工小口径血管和用于保存该血管的溶液,例如,D-Hanks溶液。本发明的人工小口径血管力学强度和稳定性提高,无毒,抗体内酶降解,抗钙化,抗血小板黏附免疫原性低,交联剂和小口径血管本身蛋白质释放极微。这些交联特性使本发明的人工小口径血管在植入体内后,利于人体自身小口径血管平滑肌细胞和血管内皮细胞的移入、增殖、覆盖和长期抗钙化。且与现有的其它方法相比,采用本发明的方法能够在较短的时间内制备得到人工小口径血管。下面通过几个实施例以进一步描述本发明方法。通过下面具体实施例介绍,以进一步阐明本发明的实质性特点和显著的进步,但本发明决非仅局限于实施例。此外,文中所提到的试剂,除非另有说明,否则都可从市场上购买得到。实施例1:脱细胞牛颈动脉小口径血管的制备1.小口径血管原材料的脱细胞处理本实施例以脱细胞牛颈动脉小口径血管作为原材料,脱细胞处理包括:(1)从屠宰场取来新鲜的牛颈动脉小口径血管,无菌环境中清除脂肪等杂物后,用D-Hanks溶液清洗三次;(2)浸泡在37°C的D-Hanks溶液中30分钟,按每厘米血管长灌流1~5mL预热的(约37°C)浓度为0.25%的胰蛋白酶的D-Hanks溶液;然后浸泡其中37°C下消化5分钟;(3)然后按每厘米血管长度灌流1~5mL的4°C以下的D-Hanks溶液终止消化,再用D-Hanks溶液清洗三次。(4)将小口径血管浸入脱细胞液(包含0.5%tritonxa0X-100、0.5%脱氧胆酸钠和0.02%乙二胺四乙酸二钠溶液(EDTA)的D-Hanks混合溶液)中48小时,在持续温和摇动的条件下脱去小口径血管表面和内部的细胞,其摇动速度为120rpm;(5)将脱去细胞的小口径血管分别浸泡在用D-Hanks液配制的核糖核酸酶(20μg/mL)和脱氧核糖核酸酶(200μg/mL)溶液中各2个小时,以除去小口径血管内部细胞残余的细胞核成分;(6)由于小血管壁有一定厚度,为充分清洗去除小血管壁内残留的细胞物质,采用D-Hanks溶液摇动清洗10次,每次1小时以上。图1显示牛颈动脉小口径血管细胞及其成分已经脱洗干净,胞外基质保留完好。2.脱细胞小口径血管的交联由于PC易溶解于水,但同时又很容易被溶解于水中的氧气所氧化,所以采用PC交联脱细胞小口径血管材料时,将PC溶液现配现用。以每1cm小口径血管加10ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡,在37°C下、240rpm摇动清洗0.5小时。然后以每1cm小口径血管加5ml的比例加入不同浓度(例如,1mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml不等)的原花青素的D-Hanks溶液浸泡,120rpm的摇动速度,37°C下交联48小时,交联PC溶液量按每厘米血管长度1~10mLxa0PC溶液计。再以每1cm小口径血管加10ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡小口径血管,在37°C下、120rpm摇动清洗240小时,每24小时换液一次。3.交联后处理与储存按上述方法交联处理的脱细胞小口径血管,用D-Hanks溶液持续清洗1~30天,每天更换D-Hanks溶液。清洗时间优选为3~5天。经过交联处理又充分清洗后的脱细胞小口径血管保存于D-Hanks溶液中备用,保存温度1~10°C。实施例2:交联处理的脱细胞小口径血管的性能检测采用下述9种方法评价按实施例1方法制备得到的交联处理的脱细胞小口径血管的性能。1.石蜡包埋常规病理切片染色(HE染色)观察将按照实施例1的方法制备得到的小口径血管通过4%福尔马林浸泡固定3天;依次浸泡在一系列浓度的乙醇溶液中(乙醇的体积分数分别为30%,50%,70%,90%,95%,100%),每个浓度10分钟,使之脱水;将样品浸入常规熔化的石蜡液体中包埋,切片后,用常规方法做HE染色,显微镜下观察是否有细胞或细胞碎片残留,并拍照。另外,将本发明PC交联的脱细胞小口径血管洗净放在干净的蓝色纸上,使用数码照相机拍照。2.力学性能:最大抗张强度的测定将按照实施例1的方法制备得到的脱细胞小口径血管与未交联的和戊二醛交联的小口径血管,用相同方法在SHIMADZU材料测试仪器上以2mm/min的速率测试最大抗张强度。样品张力测试的准备工作:将要测试的小口径血管沿纵向剪成长约25mm的长条。每组测6个样品。最大抗张强度的数值可从仪器中直接读出。3.稳定性测试3.1抗酶降解稳定性检测交联的脱细胞小口径血管可以在体外反抗酶的水解作用,反抗能力越强,降解率越低。体外酶降解的测试采用[12]介绍的方法,简要方法如下:在测定了样品的最初质量之后,将样品浸在1.8mg/mL胶原酶II的D-Hanks溶液中(酶活力单位1000U/mL,PH=7.4)在37°C、持续温和摇动的条件下反应24个小时。当加入50微升10mmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(EDTA)降解即立即终止,所有剩余的样品再次测量质量。降解率或质量损失百分率可以通过下式计算:ΔW%=(W₀-W₁)/W₀×100其中W₀表示每个样品的初始质量,W₁表示相应的每个样品酶降解后的质量。3.2交联剂PC在血管中的释放及其稳定性检测将按照实施例1的方法制备得到的小口径血管保存在D-Hanks溶液中不同的时间,选择不同的时间点取样,根据[12]介绍的方法测定浸泡液中PC的浓度,也即不同时间点交联后小口径血管释放PC的浓度。PC浓度的测试方法简要介绍如下:0.01mol/L的氯化铝溶液,加入乙酸钾调节PH=4.0(±0.02),加入1mLxa0PC溶液,混合均匀,在430nm波长处使用分光光度计测量吸光度,以此来确定PC溶液的浓度。4.钙化测试脱细胞血管、经原花青素及GA交联的血管分别纵向剪开成血管小块,按照100cm²/10mL模拟体液(simulatexa0bodyxa0fluid,SBF)的比例浸入模拟体液[Kokuboxa0T,Takadamaxa0H.,Howxa0usefulxa0isxa0SBFxa0inxa0predictingxa0inxa0vivoxa0bonebioactivity,Biomaterialsxa02006;27:2907-2910]中,于37°C、60rpm摇床中持续摇动浸泡10d。10d后取出血管,经D-Hanks溶液清洗,经梯度酒精脱水(30%、50%、70%、85%、95%、100%),每次脱水10min;再依次于100%酒精∶HMDS(六甲基二硅烷胺)=1∶1混合溶液、纯HMDS中干燥10min;最后置于干燥器中干燥过夜。制样,固定,涂导电胶,喷金,进行SEM拍照。模拟体液(SBF)配方(mM)
xa0xa0Na⁺
xa0xa0K⁺
xa0xa0Mg²⁺
xa0xa0Ca²⁺
xa0xa0Cl
xa0xa0HCO₃^-
xa0xa0HPO₄²
xa0xa0SO₄^2-
xa0xa0血浆
xa0xa0142.0
xa0xa05.0
xa0xa01.5
xa0xa02.5
xa0xa0103.0
xa0xa027.0
xa0xa01.0
xa0xa00.5
xa0xa0SBF
xa0xa0142.0
xa0xa05.0
xa0xa01.5
xa0xa02.5
xa0xa0103.0
xa0xa04.2
xa0xa01.0
xa0xa00.5
5.内皮细胞相容性检测脱细胞未交联、不同浓度原花青素交联及0.625%GA交联血管经2倍双抗D-Hanks液浸泡清洗,将血管条纵向剪开后再剪成圆形,大小与96孔板正合适,放置血管于96孔板中。HUVEC细胞经传代消化后,调节细胞密度为3×10⁶个/mL,每孔加入100μL(DMEM+10%FBS),37°C、5%CO₂培养48h(此时间正常空白孔细胞长满约95%)。将种植HUVEC细胞(人脐静脉血管内皮细胞)的血管置于2.5%戊二醛溶液中固定4h,用蒸馏水冲洗三次,注意小心清洗,防止细胞冲刷脱落。血管经梯度酒精脱水(30%,50%,70%,85%,95%,100%),每次脱水10min;再依次于100%酒精∶HMDS(六甲基二硅烷胺)=1∶1混合溶液、纯HMDS中干燥10min;最后置于干燥器中干燥过夜。制样,固定,涂导电胶,喷金,进行SEM拍照。6.血液相容性检测新鲜人血由上海市血液中心提供,加入柠檬酸钠制成抗凝血,2000rpm离心10min去除血清,D-Hanks溶液加入到沉淀中制成红细胞悬液;血管样品剪成0.5cm×0.5cm大小,放入离心管中,加入1200μLxa0D-Hanks溶液(37°C预热30min),再加入300μL稀释人血,轻轻混匀,37°C孵育60min。随后3000rpm离心5min,进行溶血现象拍照;并吸取上清,于545nm波长下测其吸光度OD值。阴性对照(negativexa0control))和阳性对照(positivexa0control)分别取等量的D-Hanks溶液和蒸馏水,操作同上。溶血率按下式计算:溶血率=(样品OD值-阴性对照OD值)/(阳性对照OD值-阴性对照OD值)×100%7.抗血栓性能检测抗血栓性能采用血小板黏附实验检测,血小板黏附越少,则抗血栓性能越高。将按照实施例1制备的小口径血管样品(n=3)纵向剪开,并剪成圆形,大小与96孔板相等,内表面向上置于96孔板中,每孔加入100μLD-Hanks,室温孵育1h。吸去D-Hanks溶液,每孔加入100μL血小板溶液,37°C下孵育1h。吸取血小板溶液进行吸附前,吸附后血小板计数,血小板粘附率=(吸附前浓度-吸附后浓度)/吸附前浓度×100%。吸附后的血管样品置于2.5%戊二醛溶液中固定4h,用蒸馏水冲洗三次,注意小心清洗。经梯度酒精脱水(30%、50%、70%、85%、95%、100%),每次脱水10min;再依次于100%酒精∶HMDS(六甲基二硅烷胺)=1∶1混合溶液、纯HMDS中干燥10min;最后置于干燥器中干燥过夜。制样,固定,涂导电胶,喷金,进行SEM观察拍照。每片血管小片取不同区域(n=3)拍照进行细胞计数统计。8.免疫原性能检测免疫原性能采用巨噬细胞粘附实验检测,巨噬细胞黏附越少,则免疫原性越低。人单核细胞(THP-1)培养在添加100U/mL青霉素,100mg/mL链霉素和10%胎牛血清(四季青)的RPMI-1640完全培养基中,置于37°C,5%CO₂的细胞培养箱培养。THP-1细胞向巨噬细胞分化:THP-1细胞传代培养于12孔板中,RPMI-1640培养基添加100ng/mLxa0PMA,100U/mL青霉素,100mg/mL链霉素和10%胎牛血清(四季青),培养处理48h。之后吸掉培养液,用D-Hanks轻轻洗两次,洗去未贴壁细胞,加入新鲜培养基,吹打细胞成细胞悬液,调整细胞密度为1×10⁶个/mL。人单核细胞(THP-1)诱导分化为巨噬细胞后,调整细胞密度为1×10⁶个/mL。将按照实施例1的方法制备得到的小口径血管样品(2.5mg/mL原花青素交联,n=3)连同脱细胞未交联和GA交联的血管样品(n=3)纵向剪开,并剪成圆形,大小与96孔板相等,内表面向上置于96孔板中,每孔加入100μL细胞悬液,37°C、5%CO2处理16h。按上述方法处理,进行SEM观察拍照。每片血管小片取不同区域(n=3)拍照进行细胞计数统计。结果如下:图2中戊二醛交联的脱细胞小口径血管有较明显的收缩,而按照实施例1所述方法以1mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml浓度的原花青素交联的脱细胞小口径血管,柔润而不收缩。图3显示原花青素交联的脱细胞小口径血管最大抗拉强度为9.8MPa,显著优于戊二醛交联的脱细胞小口径血管,也优于不交联的脱细胞小口径血管(对照)。图4显示按照实施例1所述的方法制备的不同浓度原花青素交联的脱细胞小口径血管和戊二醛交联的脱细胞小口径血管,均有较强的抗酶解能力。相对于不交联的脱细胞小口径血管,两种交联剂交联的脱细胞小口径血管无论是降解4小时还是24小时,降解率都很低,表明脱细胞小口径血管的组成分子分别被原花青素和戊二醛交联修饰。原花青素酶降解率仅为16.4%,说明原花青素具有良好的交联作用,抗酶解效果良好。图5显示原花青素交联后的脱细胞小口径血管在D-Hanks液中浸泡30天时多余的未交联的原花青素释放主要集中在前期4天内。这可能是由于交联过程中剩余的过量原花青素在清洗后少量残留所致。4天之后释放量极小,这可能是交联后力学强度稳定性良好的原因。图6显示使用5mg/mL原花青素交联的血管在SBF溶液中的抗钙化效果较好。图7显示所使用5mg/mL原花青素交联血管可使血管内皮细胞黏附、生长良好,显示出优良的细胞相容性和潜在的再细胞化能力。实施例3:脱细胞牛隐静脉小口径血管的制备脱细胞牛隐静脉小口径血管的脱细胞处理按实施例1所述的方法进行。以每1cm小口径血管加10ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡小口径血管,在37°C下、以240rpm摇动清洗0.5小时。然后以每1cm小口径血管加10ml的比例加入2.5mg/ml原花青素的D-Hanks溶液浸泡,以120rpm的摇动速度,4°C下交联120小时。再以每1cm小口径血管加5ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡小口径血管,在37°C下、以240rpm摇动清洗24小时。由此制得脱细胞牛隐静脉小口径血管。图8显示脱去细胞的牛小口径血管(隐静脉)HE染色照片。按照实施例2所述的方法对本实施例的脱细胞牛隐静脉小口径血管进行性能测定。结果显示,本实施例的脱细胞牛隐静脉小口径血管的最大抗拉强度为8.4MPa,酶降解率为17.29%,交联剂可在4天内基本释放,且无任何毒性。此外,图9A为各种交联牛隐静脉样品与抗凝血孵育60min后3000rpm离心5min后的照片。可以看出,阳性对照全部溶血(溶血率100%),脱细胞未交联,GA交联,2.5mg/mL原花青素交联组均没有溶血现象。图9B为根据测定的上清OD值,结果计算得出脱细胞未交联血管(n=3)的溶血率为0.49%,而GA和2.5mg/mL原花青素交联血管的溶血率均稍有下降,分别为0.25%,0.35%,溶血率都远低于ISOxa010993-4:2002规定的血液相容性标准最大溶血率5%。因此,原花青素同戊二醛相当,无溶血现象。图10A为牛隐静脉血管内表面血小板粘附的扫描电镜照片,可以看出,脱细胞未交联组表面粘附较多血小板,呈颗粒状,但并未完全覆盖血管表面,仍可见血管纤维结构;6.25mg/mL戊二醛交联组血管表面血小板粘附致密,完全覆盖住血管表面;而2.5mg/mL原花青素交联的血管表面粘附少量血小板,血管纤维状结构清晰可见。图10B显示粘附前后血小板溶液血小板计数(n=3)定量分析结果,表明脱细胞未交联组血小板粘附率为9.10%,戊二醛交联组血小板粘附率显著增大,为21.55%,而原花青素交联组血小板粘附率显著下降,为2.94%,与脱细胞未交联组有显著性差异,与戊二醛交联组有极显著性差异。可见,原花青素能明显的抑制血小板粘附,从而抑制血栓形成。图11为原花青素交联制备的脱细胞牛隐静脉血管的免疫原性测试结果。人单核细胞经PMA诱导处理48h后可分化为巨噬细胞,经D-Hanks洗去未贴壁巨噬细胞后,得到的细胞为巨噬细胞。巨噬细胞处理16h后通过扫描电镜观察细胞的贴壁状况,巨噬细胞黏附越多则免疫原性越强。从图11A可以看出脱细胞未交联血管(Control组)与2.5mg/mL原花青素交联血管表面都有巨噬细胞贴附,形态良好;而戊二醛交联组细胞也有贴附,但细胞呈不规则形态,这进一步说明戊二醛具有细胞毒性。图11B的细胞个数统计可以看出,三组血管间无差异,对巨噬细胞的吸附效果基本一致,相对于Control组,原花青素交联不会引起强免疫原性。实施例4:脱细胞猪心脏颈动脉或隐静脉小口径血管的制备和测试脱细胞猪心脏颈动脉或隐静脉小口径血管按实施例1所述方法作脱细胞处理,以每1cm小口径血管加10ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡小口径血管,在37°C下、60rpm摇动状态下清洗96小时。然后以每1cm小口径血管加10ml的比例加入5mg/ml原花青素的D-Hanks溶液浸泡,以120rpm的摇动速度,4°C下交联144小时。以每1cm小口径血管加10ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡小口径血管,在4°C下、360rpm清洗3次,每次10分钟。这样制得的小口径血管材料,按照实施例2所述的方法评价性能,其最大抗拉强度为9.16MPa,酶降解率为17.9%,交联剂可在4天内基本释放且无任何毒性。原花青素交联完成后不皱缩,稳定性良好,可保存在4°C下或37°C下D-Hanks溶液中至少30天。实施例5:脱细胞牛心脏颈动脉小口径血管的制备和测试脱细胞牛心脏颈动脉小口径血管按照实施例1所述的方法进行脱细胞处理,以每1cm小口径血管加100ml的比例加入0.2mg/ml原花青素的D-Hanks溶液浸泡,以120rpm的摇动速度,4°C下交联48小时。以每1cm小口径血管加10ml的比例加入D-Hanks溶液浸泡小口径血管,在4°C下、手工晃动清洗10分钟。这样制得的小口径血管材料,按照实施例2所述的方法评价性能,其最大抗拉强度为10.04MPa,酶降解率为16.1%,交联剂可在1天内基本释放且无任何毒性。原花青素交联完成后不皱缩,稳定性良好,可保存在4°C下或37°C下D-Hanks溶液中至少30天。参考文献1.Kerdjoudixa0H,etxa0al.Smallxa0vesselxa0replacementxa0byxa0humanxa0umbilicalxa0arterieswithxa0polyelectrolytexa0film-treatedxa0arteries.Jxa0Amxa0Collxa0Cardiol,2008,52:1589-97.2.李晓玲等.心血管疾病危险因素的研究现状.现代临床医学,2007,33(4):314-53.心血管病发病率上升,专家提醒要“管住嘴迈开腿”http://www.sina.com.cnxa02007年12月13日14:50CCTV《第一时间》.4.Hoenigxa0MR,etxa0al.Tissue-engineeredxa0bloodxa0vessels:Alternativexa0toautologousxa0grafts?Arteriosclerxa0Thrombxa0Vasxa0Biol,2005,25:1128-34.5.Isenbergxa0BC,etxa0al.Small-diameterxa0artificialxa0arteriesxa0engineeredxa0inxa0vitro.Circxa0Res.2006,98:25-35.6.Niklasonxa0LE,etxa0al.Functionalxa0arteriesxa0grownxa0inxa0vitro.Science,1999,284:489-93.7.Brewsterxa0LP,etxa0al.Growingxa0axa0livingxa0bloodxa0vessel:insightsxa0forxa0thexa0secondhundredxa0years.Biomaterials,2007,28:5028-32.8.Isenbergxa0BC,etxa0al.Small-di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